吡啶甲酸鉻安全性研究進展
最近由于毒膠囊事件，大家談鉻色變。實際上有毒的是六價鉻，三價鉻還可以用作食品和飼料添加劑。下面的文章介紹了吡啶甲酸鉻的安全性。
作者簡介：畢晉明，北京華谷生物營養科技發展有限公司，碩士。
張敏紅，中國農業科學院研究員，博士生導師，主要從事動物營養方面研究礦物元素是動物營養中的一大類無機營養素。目前已查明的必需微量元素有鐵、鋅、銅、錳、碘、硒、鈷、鉬、氟、鉻、硼等12種，且必須由外界供給。各元素在供給量上存在一安全范圍，添加量不足導致相應元素缺乏癥，添加量超過安全范圍便導致機體中毒。同時發現，畜禽對微量元素的耐受性也隨動物種類而異。豬、禽對鐵的耐受量為3000mg/kg、1000mg/kg，對銅的耐受量為250mg/kg、300mg/kg，其他微量元素同樣具有類似效應。當微量元素在飼糧中含量較低時為必需礦物元素，在含量過高情況下則可能是有毒有害元素，必需礦物元素和有毒有害元素對動物而言是相對的。
鉻元素作為必需微量元素之一，其生理作用日益受到研究者重視。研究表明：鉻與糖代謝、脂代謝、蛋白質代謝以及核酸代謝密切相關。同時發現，各種動物對鉻的耐受力都較強?？赡褪茔t的氧化物3000mg/kg，鉻的氯化物可耐受1000mg/kg。吡啶甲酸鉻作為有機鉻制劑，其安全性也日益受到關注。在畜牧生產上，吡啶甲酸鉻對緩解環境應激、提高瘦肉率、增強抵抗力均有明顯的促進作用，而被廣泛應用。但究其使用量而言，雖然一些國家已批準吡啶甲酸鉻在畜禽日糧中的添加，但目前尚未正式發布動物最低需要量和最高耐受量數據。研究報道，血漿鉻的正常生理濃度為0.1-2.1μg/ml(Cerullietal.,1998)，人類肝中鉻的生理濃度為5.4-470ηg/g肝濕重（－0.1-9μM）（Versieck，1985），超量添加（遠高于生理劑量）吡啶甲酸鉻有可能產生DNA毒性和細胞毒性。為此，本文對吡啶甲酸鉻的安全性進行綜述，以便為日后吡啶甲酸鉻的研究提供理論基礎。
1、吡啶甲酸鉻理化特性及結構特征
吡啶甲酸鉻（Chromiumpicolinate），分子式Cr(C6H4NO2)3，分子量為418.33，紫紅色結晶性細小粉末，常溫下穩定，微溶于水，不溶于乙醇。整個分子結構呈電中性，且具有疏水特性，因此可以以完整的結構進行跨膜吸收。吡啶甲酸鉻的分子結構與GTF部分相似。1977年，Toepfer認為GTF是鉻的生物活性形式，其結構為煙酸-鉻-煙酸與天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸形成的配合體。吡啶甲酸鉻的類GTF結構決定了自身較好的吸收率，并能更有效地發揮自身的生物學功能。據報道，普通鉻制劑吸收率為0.5%左右，而吡啶甲酸鉻吸收率達2%－5%（Anderson，1996）。
2、吡啶甲酸鉻安全性研究
吡啶甲酸鉻作為營養添加劑，已經得到廣泛的應用。但是從1995年首次報道了吡啶甲酸鉻的危害性之后，吡啶甲酸鉻的安全性問題就一直成為研究的熱點。迄今為止，對吡啶甲酸鉻的安全性研究已得到一些數據，但結論不盡相同。
據NTP（NationalToxicologyProgram）報道，不管有無添加小鼠肝臟S9代謝激活物，吡啶甲酸鉻對TA1535、TA97、TA98、TA100、TA102、TA104細胞株均未致突變性。在小鼠日糧中添加2500mg/kg.bw的一水吡啶甲酸鉻，小鼠骨髓細胞未發現基因斷裂效應。Kato等（1998）對十位肥胖女士（每日服用400mg吡啶甲酸鉻）觀察，八周后尿樣中DNA堿基氧化產物5-羥甲基尿嘧啶水平沒有發生變化。Anderson等(1997)向小鼠日糧中添加100mg/kg日糧的鉻（吡啶甲酸鉻形式），飼喂24周也未發現吡啶甲酸鉻急性毒性。
針對超量添加吡啶甲酸鉻時的細胞毒性和基因毒性也有研究報道。吡啶甲酸鉻細胞毒性主要體現在細胞凋亡和線粒體損傷上。Manygoats(2002)研究發現，1mM（125倍適宜量）吡啶甲酸鉻添加可導致線粒體損傷和細胞凋亡，可能是由于線粒體呼吸作用受到抑制（主要發生在復合體Ⅰ上），NADH的合成減少，消耗增大所致；線粒體內膜通道的破壞（線粒體的滲透性轉換孔—MPT途徑），導致線粒體基質成分喪失，線粒體功能和細胞器發生實質性膨脹，接著線粒體外膜破裂，細胞色素C和凋亡誘導因子釋放，進而激活核酸內切酶和Caspase，引發細胞凋亡(GreenD等,1998)。
吡啶甲酸鉻基因毒性主要表現在DNA堿基氧化、DNA鏈斷裂和基因突變上。Hepburn(2003)研究發現：給小鼠注射吡啶甲酸鉻80天后（~600uMCr,75倍適宜量），造成脂質過氧化，并使尿中DNA堿基氧化產物8-oxo-dG含量升高。另有報道提示：在諸如維生素C之類的生物抗氧化劑存在的條件下，吡啶甲酸鉻可以斷裂DNA雙鏈，使超螺旋DNA松弛。Stohs(1998)等研究發現，50mg/ml（120mM）吡啶甲酸鉻處理巨噬細胞J774A.124h后，造成DNA鏈斷裂，細胞中存在DNA碎片。SpeetjensJK(1999)的體外實驗研究發現：吡啶甲酸鉻可以導致質粒DNA單鏈斷裂。在小鼠淋巴細胞上的毒理試驗表明：不管是否添加S9，1.2mM（150倍適宜量）、2.39mM吡啶甲酸鉻均顯著誘導淋巴細胞基因突變（Whittaker等，2005）。
由此可見，在體內研究吡啶甲酸鉻的安全性上，除靜脈注射途徑外，未見毒性報道。這可能與吡啶甲酸鉻的吸收率（2%－5%）以及機體內環境代謝有關；吡啶甲酸鉻靜脈注射途徑的吸收率遠高于腸道吸收率。體外細胞培養研究上，多數實驗報道，超量添加吡啶甲酸鉻（>0.6mM，75倍適宜量）對細胞和DNA產生毒性作用。但也有個別試驗報道，高劑量吡啶甲酸鉻（>0.6mM）對細胞和DNA不產生毒性作用，這可能與不同細胞株的耐受性不同和吡啶甲酸鉻的吸收率降低有關。
3、超量添加吡啶甲酸鉻毒性作用的代謝途徑
迄今為止，從國內外吡啶甲酸鉻安全性研究報道中發現，吡啶甲酸鉻毒性作用與其代謝途徑密切相關，其代謝途徑主要歸納為兩條。
3.1吡啶甲酸鉻氧化-還原途徑
吡啶甲酸鉻在胞內還原劑（維生素C，硫醇等）存在的條件下發生類Fenton反應。在此過程中生成大量對DNA穩定性影響的ROS，如超氧離子，過氧離子，羥基自由基，過氧化氫等。ROS的產生，使蛋白質、脂質過氧化生成羰基蛋白、脂質過氧化物等氧化產物，同時使細胞膜通透性、膜流動性降低，細胞脆性升高，細胞完整性遭到破壞。另一方面，ROS產生后降低了Ca2+-ATP酶與鈣通道活性，造成Ca超載，從而激活Ca2+-依賴蛋白酶，磷脂酶（PLA2）及核酸內切酶（劉欣等，2001）。PLA2的激活,使膜磷脂降解,磷脂含量降低,導致膜通透性增加,Ca2+易于進入細胞內,使細胞內Ca2+超載，形成惡性循環。核酸內切酶的激活,催化基因組DNA在核小體間降解;Ca2+濃度的升高還可激活谷氨酰胺轉化酶和蛋白激酶C等,使細胞骨架斷裂,細胞漿蛋白交叉聯合,促使凋亡發生（Ui-Tei等，2000）。此外，Ca2+濃度的改變還可激活凋亡相關蛋白激酶與Caspase家族的級聯反應，最終導致細胞凋亡。Fenton反應增強后，ROS基團可氧化DNA堿基。通過脫氧核糖的C8位點上的脫氫作用氧化DNA，使鳥嘌呤氧化成為8-oxo-dG；胸腺嘧啶氧化生成5-羥甲基尿嘧啶。
3.2吡啶甲酸鉻酶促分解途徑
在胰島素依賴性細胞中，Apo-LMWCr從吡啶甲酸鉻復合體中對鉻進行吸附，使吡啶甲酸脫離復合物，游離于胞內，從而造成細胞毒性。在體內吡啶甲酸是色氨酸的代謝產物，它的產生可以誘導一氧化氮合酶表達，導致氮自由基產生，進而引發細胞凋亡。吡啶甲酸還可改變細胞膜的流動性，并能阻止細胞周期（S期）循環。毒理學試驗表明：吡啶甲酸在胞內可以螯合其他金屬離子發生Fenton反應生成活性氧自由基，并且發現在磷酸鹽緩沖液中，吡啶甲酸能增強Cr(pic)3的類Fenton反應。Stearns(2002)研究發現：1mM（120倍適宜量）的吡啶甲酸鉻處理組48h后發現細胞存活率為（68±16）%，而吡啶甲酸組僅為27%；但是發現該濃度的吡啶甲酸并不存在致突變性。Manygoats(2002)等對CHO細胞研究發現：吡啶甲酸鉻添加量為1mM時，48h后發現37%的細胞發生凋亡，當量的吡啶甲酸產生的細胞毒性比吡啶甲酸鉻更強，1.5mM（180倍適宜量）的吡啶甲酸處理組的細胞成活率僅有49%，51%的細胞發生凋亡，71%的線粒體受損。另有研究發現：3mM濃度的吡啶甲酸24h后發現線粒體損傷，5－10mM的吡啶甲酸12－24h后細胞發生凋亡（Ogata等，1998）?？梢娫诩毎拘陨?，吡啶甲酸強于吡啶甲酸鉻。
在微粒體中吡啶甲酸鉻可分解并發生醯胺化、甲基化反應。將人微粒體與吡啶甲酸鉻共同孵育1h和3h后，分析得出66%的吡啶甲酸鉻被代謝，通過高壓液相色譜分析兩時間點的結果沒有差異。為了驗證結果，采用雞肝細胞體外培養實驗后發現，吡啶甲酸鉻全部被代謝，三價鉻離子脫離。三價鉻離子的分離可能會對DNA結構與DNA復制過程造成負面影響，從而阻止細胞的生長增殖，其可能機理如下：Cr（Ⅲ）可與磷酸骨架（Tsapakos等，1983）、鳥嘌呤、染色體組蛋白（H2AX）（Miller等，1989）、染色體結構維持蛋白（SMC）結合（Timothy，2004），從而影響DNA的復制進程。還可與DNA復制所需的酶類結合，如拓撲異構酶的結合，使DNA松弛活性降低，DNA雙鏈不能完全松弛，導致復制終止；與DNA聚合酶（Tkeshelashvili，1980）、RNA聚合酶（Okada等，1981），翻譯延長因子復合體（Wang等，1997）的結合，導致復制、轉錄、翻譯過程受阻。
DNA內鏈交聯（ICL）作為DNA加合損傷的另一方式，占DNA-Cr加合物的10%左右，也可阻止DNA的復制。已有研究報道：ICL可以與鳥嘌呤上的N-7殘基（Bauer等，1997），以及與磷酸骨架一定程度的結合，從而物理性地阻止模板DNA的復制（Bridgewater等，1994）。在細胞水平上表現為細胞周期循環中斷，甚至導致細胞凋亡、程序性死亡。另有資料顯示：Cr-DNA加合物誘導的單堿基的改變通常導致G/C→A/T的轉變與G/C→T/A的顛換，同時發現，與鉻螯合的配體差異，可導致堿基替代頻率發生變化（Quievryn等,2003；Zhitkovich等，2001）。
4、結語
適宜量吡啶甲酸鉻添加對機體代謝有著積極作用，當添加量遠高于生理劑量時有可能產生細胞毒性和DNA毒性。在體內研究吡啶甲酸鉻的安全性上，除靜脈注射途徑外，未見毒性報道。在體外研究上，超量添加吡啶甲酸鉻（>0.6mM）時可能出現細胞毒性和DNA毒性。其毒性作用與其代謝途徑密切相關，但作用機理尚不完全清楚，有待于進一步研究探索。
